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2023-04-27 20:04
高效液相色譜如何選擇？ 已關(guān)閉
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高效液相色譜儀(HPLC)是應(yīng)用高效液相色譜原理，主要用于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定的和分子量大的有機(jī)化合物的儀器設(shè)備。具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。該法已成為現(xiàn)代分析技術(shù)的重要手段之一，目前在化學(xué)、化工、醫(yī)藥、生化、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等科學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。
和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統(tǒng)也由固定相和流動(dòng)相組成，這里主要講一下固定相，也就是色譜柱填充物。 一、固定相： 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。 剛性固體：以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.0×108~1.0×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，泛用性極強(qiáng)。 硬膠：主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類： 1.表面多孔型固定相 它的基體是實(shí)心玻璃球，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對(duì)死體積小、柱效高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)到平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，大允許量受到限制。 2.全多孔型固定相 由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆粒很細(xì)（5~10um），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。 二：色譜柱基質(zhì)選擇： 1.硅膠基質(zhì)： 1.1反相色譜柱： 反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)組合最先被沖出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。 1.2正相色譜： 正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)，以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基團(tuán)(NH2,APS)和氰基團(tuán)(CN，CPS)的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其他團(tuán)的極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中的各組份的極性大小，即極性強(qiáng)弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低，如：正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等。 1.3離子交換色譜柱： 主要是以磺化交聯(lián)強(qiáng)陰/陽離子鍵合硅膠色譜柱，常用規(guī)格：強(qiáng)陰離子色譜柱(SAX)，強(qiáng)陽離子交換色譜柱(SCX) 2.聚合物基質(zhì)： 聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1～14均可使用。相對(duì)與硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強(qiáng)的疏水性；聚合物填料的缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。小分子在這種基質(zhì)中柱效低。對(duì)于大分子像蛋白質(zhì)或合成的高聚物，聚合物基質(zhì)的效能比得上陶瓷性基質(zhì)。因此，聚合物基質(zhì)廣泛用于分離大分子物質(zhì)。 3.其他無機(jī)填料 其它HPLC的無機(jī)填料，由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)，石墨化碳可用于分離某些幾何導(dǎo)構(gòu)體，又由于HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。 氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可在PH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用。 但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定的限制；新型氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用PH范圍1～14，溫度可達(dá)100℃，其重要用途與優(yōu)勢(shì)尚在進(jìn)行中。 一句話選擇：硅膠基質(zhì)的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質(zhì)，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。 色譜柱尺寸的選擇：
三、流動(dòng)相： 對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是： 1.溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。 2.溶劑與檢測(cè)器匹配。 3.純度高：色譜純及以上。 4.化學(xué)穩(wěn)定性好 5.低粘度：若使用高粘度溶劑，色譜系統(tǒng)壓力增高，不利于分離。 常用的低粘度溶劑：丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。 四、檢測(cè)器： 選用的檢測(cè)器應(yīng)該清晰的區(qū)別流動(dòng)相與被檢測(cè)物質(zhì)。 五、進(jìn)樣器 除了一些實(shí)驗(yàn)室的樣品較少以外需要手動(dòng)進(jìn)樣以外，現(xiàn)在一般選擇自動(dòng)進(jìn)樣器。
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